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透射电子显微镜

BIOX.CN 2005-4-26 20:29:20 来源:星原生物
 

    1、基本原理

    在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构,这些结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),电子束的波长要比可见光和紫外光短得多,并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。

    电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样,所不同的是前者用电子束作光源,用电磁场作透镜。另外,由于电子束的穿透力很弱,因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机(ultramicrotome)制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

不同光源的波长

    

可见光

紫外光

X射线

α射线

电子束

0.1Kv

10Kv

波长(nm

390~760

13~390

0.05~13

0.005~1

0.123

0.0122

JEM-1011透射电子显微镜

    2、制样技术

    1)超薄切片

    通常以锇酸和戊二醛固定样品,以环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片(图2-13),切片厚度20~50nm,切片采用重金属盐染色,以增大反差。

莱卡超薄切片机

内质网透射电镜图(伪彩色)

    2)负染技术

    负染就是用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)对铺展在载网上的样品进行染色;吸去染料,样品干燥后,样品凹陷处铺了一薄层重金属盐,而凸的出地方则没有染料沉积,从而出现负染效果(图2-15),分辨力可达1.5nm左右。

肌动蛋白纤维的负染电镜照片

    3)冰冻蚀刻

    冰冻蚀刻(freeze-etching)亦称冰冻断裂(freeze-fracture)。标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中,进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开,升温后,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构,称为蚀刻(etching)。蚀刻后,向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。复膜显示出了标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。

冰冻蚀刻电镜照片




阅读: 责任编辑:冰瀑

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